Diseño y evaluación de la expresión de una potencial vacuna de ADN contra el virus de la Tilapia de Lago (TiLV)

El Virus de la Tilapia del Lago (TiLV), es un patógeno causante de mortalidades masivas tanto en poblaciones de tilapias cultivadas y silvestres alrededor del mundo. El desarrollo de una vacuna efectiva contra este patógeno emergente es imperativo para prevenir pérdidas económicas. En este trabajo se diseñó y evaluó un vector de expresión como una potencial vacuna de ADN contra este virus. Inicialmente, se realizó un análisis de enhebramiento para predecir las estructuras tridimensionales y las funciones de las proteínas del TiLV. Se encontraron homologías estructurales entre las proteínas correspondientes al segmento genómico 1 y al segmento genómico 4 del TiLV, con las proteínas de ARN polimerasa dependiente de ARN del virus de la influenza B (56%) y la proteína neuraminidasa que pertenece a la cápside del virus de la influenza A (12%), respectivamente. Se insertó el producto de PCR del gen neuraminidasa viral en el vector plasmídico de expresión pCMV. Finalmente, se inyectó el constructo plasmídico en juveniles de la tilapia del Nilo Oreochromis niloticus y se midió su expresión mediante RT-PCR en tiempo real a las 8h, 16h, 24h, 72h después de la segunda inyección inmunizante. Se logró detectar expresión génica en los cuatro tiempos evaluados, con mayor expresión a las 16 horas post inyección. Estos resultados constituyen el primer paso para el desarrollo de una vacuna efectiva para la protección de los stocks de tilapias alrededor del mundo.

Tilapia Lake Virus (TiLV) is a pathogen that causes massive mortalities in both cultured and wild tilapia populations around the world. The development of an effective vaccine against this emerging pathogen is imperative to prevent economic losses. In this work an expression vector was designed and evaluated as a potential DNA vaccine against this virus. Initially, a threading analysis was done to predict the threedimensional structures and functions of the TiLV proteins. Structural homologies were found between the TiLV proteins corresponding to the genomic segment 1 and the genomic segment 4, with the RNA-dependent RNA polymerase proteins of the influenza B virus (56%) and the neuraminidase protein belonging to the influenza A virus capsid (12%), respectively. The PCR product of the viral neuraminidase gene was inserted into the expression plasmid vector pCMV. Finally, the plasmid construct was injected into juveniles of the Nile tilapia Oreochromis niloticus and its expression was measured by real time RT-PCR at 8h, 16h, 24h, and 72h after the second immunizing injection. It was possible to detect gene expression in the four evaluated times and greater expression at 16 hours post injection. These results are the first step in the development of an effective vaccine for the protection of tilapia stocks around the world.

Adiposidad visceral, patogenia y medición / Visceral adiposity, pathogenesis and measurement

El reconocimiento del tejido adiposo como un órgano endocrino sumamente complejo, capaz de secretar una serie de biomoléculas conocidas como adipocitoquinas (o adipoquinas) con un impacto en diversos procesos como, regulación de mecanismos de hambre y saciedad (y por ende balance energético), sensibilidad a la insulina, respuesta inmune, metabolismo lipídico, entre otros, sitúan en el tejido adiposo un papel protagónico en la génesis de las complicaciones metabólicas y cardiovasculares de la obesidad. Se ha planteado como principal responsable la disfunción del tejido adiposo visceral, fenómeno conocido como adipocitopatía. Entre los mecanismos propuestos de disfunción adipocitaria se señalan: alteración en la adipogénesis que limita la capacidad expansora del tejido adiposo subcutáneo, favoreciendo la hipertrofia de depósitos viscerales con expresión subsiguiente de su potencial proinflamatorio, hipoxia por angiogénesis limitada y acumulación intraorganelar de productos intermediarios del metabolismo lipídico (lipotoxicidad), con la consecuente resistencia a la insulina y sus efectos deletéreos. En este artículo se revisan los mecanismos implicados en este fenómeno, así como los métodos directos e indirectos de medición de los diferentes depósitos de grasa visceral, con especial énfasis en aquellos de más fácil aplicación en la práctica clínica diaria.

The recognition of adipose tissue as a highly complex endocrine organ, capable of secreting a series of biomolecules known as adipocytokines (or adipokines) with an impact on various processes such as regulation of hunger and satiety mechanisms (and therefore energy balance), insulin sensitivity, immune response, lipid metabolism, among others, place in adipose tissue a leading role in the genesis of the metabolic and cardiovascular complications of obesity. The dysfunction of visceral adipose tissue, a phenomenon known as adiposopathy, has been the main culprit. Among the proposed mechanisms of adipocyte dysfunction are: alteration in adipogenesis that limits the capacity of the subcutaneous adipose tissue to expand, favoring the hypertrophy of visceral deposits with subsequent expression of its proinflammatory potential, hypoxia due to limited angiogenesis and intraorganellar accumulation of intermediate products of lipid metabolism (lipotoxicity), with the consequent resistance to insulin and its deleterious effects. In this article we review the mechanisms involved in this phenomenon, as well as the direct and indirect methods of measurement of the different visceral fat deposits, with special emphasis on those that are easier to apply in daily clinical practice.

Caracterización de la enzima similar a trombina del veneno de Bothrops pictus "jergón de costa" / Characterization of thrombin like enzyme from Bothrops pictus venom

Realizar una caracterización bioquímica y molecular del principio coagulante del veneno de Bothrops pictus. Materiales y métodos. Se realizó la amplificación del gen a partir de cDNA, se analizó la homología de la secuencia nucleotídica y de la proteína deducida. Se procedió a purificar la enzima para los análisis de secuenciación directa N terminal de los primeros 20 aminoácidos y los ensayos de coagulación sobre plasma humano y fibrinógeno humano, por otro lado, se evaluó el patrón de corte del fibrinógeno por medio de PAGE SDS y la actividad defibrinogenante en roedores albinos (18-22 g). Se determinó el contenido de carbohidratos asociados, el efecto de inhibidores clásicos de proteasas y el efecto de iones bajo la forma de cloruros. Resultados. La enzima mostró homología en la estructura primaria con otras TLEs reportadas para la familia Viperidae, la dosis coagulante mínima (DCM) sobre plasma y fibrinógeno humano fue de 18 y 6 ug respectivamente y su potencia coagulante fue de 131,1 NHI unidades de trombina. La enzima se mostró estable a condiciones fisiológicas y prescinde de iones para su actividad. Los carbohidratos asociados detectados fueron hexosas (25,76%), hexosaminas (13,1%) y ácido siálico (0,76%). Los agentes fluoruro de fenil metil sulfonil floruro (PMSF) ditiotreitol (DTT) fueron los principales inhibidores de la actividad enzimática en tanto que la heparina no tuvo efecto inhibidor. Conclusiones. El principio coagulante del veneno de Bothrops pictus es una enzima similar a trombina...

To perform a biochemical and molecular characterization of the coagulant principle from Bothrops pictus venom. Materials and methods. We amplified the genetic sequence of this enzyme from cDNA and analyzed the homology of its nucleotide sequence and its deduced protein. This enzyme was also purified for N-terminal sequencing of first 20 amino acids and for coagulation assays using human plasma and human fibrinogen. Furthermore, cleavage pattern on fibrinogen was evaluated using SDS-PAGE and defibrinogenant activity on white mice (18-22 g). Finally, associated carbohydrate content, effect of protease inhibitors and chloride ions on its enzymatic activity were analyzed. Results. The Thrombin-like Enzyme from Bothrops pictus showed homology at primary level of structure with other previously reported TLEs from Viperidae family. Minimum Coagulant Dosis (MCD) on plasma and human fibrinogen were 18 and 6 ug, respectively, and its coagulant potency was 131.1 NHI Thrombin units. This TLE was stable under physiological conditions and chloride ions are not necessary for its activity. Detected associated carbohydrates were hexoses (25.76%), hexosamines (13.12%) and sialic acid (0.76%). Phenyl methyl sulphonyl fluoride (PMSF) and dithiothreitol (DTT) were the main inhibitors of its enzymatic activity, but heparin had no inhibitor effect. Conclusions. The coagulant principle of Bothrops pictus venom is a Thrombin-like enzyme...

Eficacia experimental de anticuerpos IgY producidos en huevos, contra el veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox / Experimental efficacy of IgY antibodies produced in eggs against the venom of the Peruvian snake Bothrops atrox

Objetivos. Desarrollar un protocolo de inmunización para producir inmunoglobulinas IgY de origen aviar contra el veneno de la serpiente peruana Bothrops atrox y evaluar la capacidad neutralizante. Materiales y métodos. Se inmunizaron seis gallinas de postura de la raza hy line brown con 500 μg/dosis de veneno de B. atrox en un periodo de dos meses. Cada semana, los huevos fueron colectados para el aislamiento de inmunoglobulinas IgY a partir de la yema, usando dos pasos consecutivos con αcido caprνlico y sulfato de amonio. La detecciσn de anticuerpos se realizσ por inmunodifusiσn doble mientras que el tνtulo y reactividad cruzada se determinaron por las técnicas de ELISA y Western blot. El cálculo de DL50 y de la DE50 del antiveneno IgY producido se realizó utilizando el método de Probits. Resultados. La masa de anticuerpos aislados fue de 8,5 ± 1,35 mg de IgY/mL de yema. Asimismo, la DE50 del antiveneno aviar fue calculada en 575 μL de antiveneno/mg de veneno. Adicionalmente, los ensayos de reactividad cruzada mostraron que el veneno de B. atrox comparte mas epνtopes comunes con el veneno de B. brazili (47%) que con otros veneno del mismo género, en tanto que los venenos de Lachesis muta (19%) y Crotalus durissus (12%) mostraron una baja reactividad cruzada. Conclusiones. Se ha obtenido IgY purificada contra el veneno de B. atrox con capacidad neutralizante y se ha demostrado su utilidad como herramienta inmunoanalítica para evaluar la reactividad cruzada con venenos de otras especies.

Objectives. To develop an immunization protocol in order to produce avian IgY immunoglobulins against Bothrops atrox Peruvian snake venom and to evaluate its neutralizing capacity. Materials and methods. Six Hy Line Brown hens were immunized each two weeks using 500μg/doses of B. atrox venom in a period of two months. Each week, eggs were collected for IgY isolation from yolk using two consecutive steps with caprilic acid and ammonium sulfate. Detection of IgY anti-B. atrox were performed by double immunodiffusion, whereas title and cross-reactivity were analyzed using ELISA and Western Blot technics, respectively. Furthermore, letal dose (DL50) and Medium Effective Dose (DE50) were obtained by Probit analysis. Results. As a result of this protocol, chicken IgY’s were obtained in a concentration of 8,5 ± 1,35 mg/yolk mL. DE50 from avian antivenom was 575 μL/venom mg. Cross-reactivity studies showed Bothrops atrox venom share more commom epitopes with Bothrops brazili (47%) than others Bothrops venoms showing Lachesis muta (19%) and Crotalus durissus (12%) venoms a low crossing reactivity, instead. Conclusions. Using this procedure, we could purify chicken IgY with a neutralizant capacity of B. atrox venom which is comparable to the antivenom of equine origin and demonstrate its capacity as a immunoanalitical tool to evaluate the cross reactivity with others peruvian snakes.

Características bioquímicas y evaluación preclínica de un antiveneno botrópico liofilizado contra el veneno de la serpiente Bothrops atrox / Biochemicals characteristics and pre-clinical testing of lyophilized bothropic antivenom against bothrops atrox snake venom

Se han estudiado las características bioquímicas y la capacidad neutralizante del antiveneno botrópico liofilizado producido por el Instituto Nacional de Salud (Lima, Perú), se encontró que posee 51,4 mg/mL de proteínas, las preparaciones liofilizadas se reconstituyen en un periodo de 10 min alcanzando valores de Abs600nm y pH de 0,091 y 7,0, respectivamente. Para el caso de las actividades tóxicas delveneno en estudio se obtuvieron valores de toxicidad DL50: 3,33 μg/g ratón, dosis hemorrágica mínima: 4,10 mas o menos 0,64 μg, dosis miotóxica mínima 30,2 mas o menos 2,5 μg, dosis coagulante mínima: 4,50 mas o menos 0,6 μg y dosis defibrinante mínima: 8 μg, y valores de dosis efectiva del antiveneno evaluado de 140,48 (120,09-164,33), 230,67 mas o menos11,78, 316,56 mas o menos 40,31, 105,5 mas o menos 4,2 y 500 μL antiveneno/mg veneno, respectivamente, lo cual indica que posee capacidad para neutralizar tales parámetros. Por estas razones se concluye que el producto biológico investigado cumple con los requerimientos de la Organización Mundial de la Salud (OMS) para ser considerado un antiveneno neutralizante de las principales actividades biológicas antes señaladas.

Biochemical features and neutralizing capacity of lyophilized bothropic antivenom elaborated by the Peruvian National Health Institute (Lima, Peru). It was found that the antivenom protein contents is 51.4 mg/mL. Lyophilized preparations can be reconstituted in 10 minutes, reaching Abs600nm and pH values reported as 0.091 and 7.0, respectively. Regarding toxicity of the venom for mice, LD50 was 3.33 μg,minimal hemorrhagic dose was 4.10 more or less 0.64 μg, minimal myotoxic dose was 30.2 more or less 2.5 μg, minimal coagulant dose was 4.50 more or less 0.6 μg, and the minimal defibrinating dose was 8 μg; and the effective dose values of the antivenom for the aforementioned parameters were140.48 (120.09-164.33), 230.67 more or less 11.78, 316.56 more or less 40.31, 105.5 more or less 4.2, and 500 μL antivenom/mg venom, respectively, indicating that this preparation has the ability to neutralize each of the parameters tested. For these reasons we conclude that the investigated product complies with the World Health Organization (WHO) requirements to be considered an effective antivenom capable of neutralizing themain biological activities previously mentioned.

Acción del antiveneno botrópico polivalente sobre las actividades proteolíticas presentes en los venenos de serpientes peruanas / Action of polivalent bothropic antivenom on proteolytic activities from peruvian snake venoms

Los venenos de las serpientes peruanas causantes de la mayoría de accidentes ofídicos, contienen enzimas proteolíticas que pueden degradar proteínas tisulares y plasmáticas, así como causar hipotensión y coagulación sanguínea. Objetivos. Evaluar la capacidadinhibitoria del antiveneno botrópico polivalente al estado líquido producido por el Instituto Nacional de Salud del Perú (INS) sobre las actividades caseinolítica, coagulante y amidolítica de los venenos de Bothrops atrox, Bothrops brazili, Bothrops pictus y Bothrops barnetti. Materiales y métodos. Se usaron en cada caso sustratos como caseína, fibrinógeno bovino y el cromógeno benzoil-arginil-p-nitroanilida(BApNA) respectivamente, y se midieron los cambios en los valores de la actividad enzimática a ½, 1 y 2 dosis del antiveneno tanto al estado natural como calentado a 37 °C durante cinco días. Resultados. La actividad caseinolítica es la más resistente a la inhibición especialmente por el suero no calentado en tanto que, la actividad amidolítica fue severamente inhibida principalmente en los venenosde B. pictus y B. atrox. Así mismo la actividad coagulante fue totalmente inhibida en el veneno de B. pictus, mostrándose a su vez unaelevada inhibición sobre los venenos de B. brazili y B. atrox. Para las actividades coagulante y amidolítica, los sueros calentados fueron menos efectivos que aquellos al estado natural. Conclusiones. El suero antibotrópico polivalente producido por el INS es efectivo parainhibir las actividades proteolíticas de los venenos de las serpientes peruanas ensayadas.

Peruvian snake venoms responsible for most of ophidism accidents, contain proteolytic enzymes that can degrade tissue and plasmatic proteins, as well as cause hypotension and blood coagulation. Objectives. The inhibiting capacity of liquid polyvalent bothropic antivenom produced by Instituto Nacional de Salud (INS), has been evaluated on caseinolytic, coagulant and amidolytic activities on Bothrops atrox,Bothrops brazili, Bothrops pictus and Bothrops barnetti venoms. Material and methods. Using in each case casein, bovine fibrinogen and the chromogenic substrate BApNA respectively, measuring changes in values of enzymatic activity at ½, 1 and 2 doses of either natural and heating (incubated at 37 °C during five days) antivenom. Results. Caseinolytic activity is more resistant to inhibition especially by thenatural antivenom, amidolytic activity was severely inhibited mainly in B. pictus and B. atrox venoms. Also coagulant activity was totallyinhibited in B. pictus venom, being high on B. brazili and B. atrox venoms. For coagulant and amidolytic activities, heated antivenom was less effective than natural one. Conclusions. The bothropic antivenom produced by INS is effective to inhibit the proteolytic activity from Peruvian snake venoms tested.

Is tumor necrosis factor - 376a promoter polymorphism associated with susceptibility to multiple sclerosis? / ¿El polimorfismo-376A del promotor del gen del factor de necrosis tumoral se asocia con una mayor susceptibilidad a padecer esclerosis múltiple?

A single nucleotide polymorphism (SNP) at position -376 of the tumor necrosis factor α gene (TNFA) has been associated with susceptibility to multiple sclerosis (MS) in Spain. However, no association was found in populations from the USA and The Netherlands. Here we investigate the association between the TNFA - 376A SNP and MS susceptibility in Argentinean patients with MS. The A/G genotype was found in 4.4% of patients (n=90) and in 4.8% of healthy individuals (n=84; p=0.92; odds ratio=0.93; confidence interval: 0.23- 3.84). Thus, no significant differences in genotype and allele frequencies were found between healthy individuals and patients with MS in Argentina.

Un polimorfismo de nucleótido único (SNP, por sus iniciales en inglés) en la posición -376 del gen codificante del factor de necrosis tumoral α (TNFA) ha sido asociado en España con un mayor riesgo a padecer esclerosis múltiple (EM). Sin embargo, esta asociación no fue encontrada en estudios hechos en poblaciones provenientes de los EE.UU. y Holanda. Aquí investigamos la asociación entre el SNP TNFA -376A y el desarrollo de EM en una población de pacientes argentinos con EM. El genotipo A/G fue encontrado en 4.4% de los pacientes (n=90) y en 4.8% de los controles sanos (n=84; p=0.92; odds ratio=0.93; intervalo de confianza: 0.23-3.84). En consecuencia, no encontramos diferencias en las frecuencias alélicas y genotípicas entre los sujetos enfermos y los controles sanos en Argentina.